AEG MICROMAT 21SR-d/w- Anleitungen

Inhaltsverzeichnis IV 4.7.1 β-Galaktosidase-Aktivität von xylA::lacZ 68 4.7.2 β-Galaktosidase-Aktivität von xynP::lacZ 69 4.8 RNA-Hybridisierung zur Detektion des xynP -Transkripts 71 4.8.1 Herstellung der genspezifischen RNA-Sonde 71 4.8.2 In vitro- Transkript von xynP für die Erstellung der Standa...

Zusammenfassung 1 1 Zusammenfassung Der zentrale Regulator der Kohlenstoffkatabolitenregulation (KKR), das Katabolitkontrollprotein A (CcpA), reguliert etwa 10 % aller Gene in B. subtilis , welche neben dem Kohlenstoffmetabolismus auch in den Überflussstoffwechsel, den Stickstoff- und Phosphatmetabo...

Einleitung 2 2 Einleitung 2.1 Der Modellorganismus Bacillus subtilis Bacillus subtilis ist ein Vertreter der apathogenen Gram-positiven Bakterien mit niedrigem GC-Gehalt der DNA (Stülke & Hillen, 2000). Durch die phylogenetische Nähe zu pathogenen Vertretern der Bazillen (Alcaraz et al. , 2010) ...

Einleitung 3 2.2 Das Phosphoenolpyruvat- Phosphotransferasesystem Die Aufnahme vieler bevorzugter Kohlenstoffquellen wie Glukose, Fruktose, Mannose, Saccharose und Mannitol wird durch das Phosphoenolpyruvat- Phosphotransferasesystem (PTS) gesteuert (Postma et al. , 1993; Reizer et al. , 1999; Saier ...

Einleitung 4 2.3 Kohlenstoffkatabolitenregulation in Bacillus subtilis Die Kohlenstoffkatabolitenregulation (KKR) steuert die Verwertung der zur Verfügung stehenden Kohlenstoffquellen, um der Zelle das schnellste Wachstum zu ermöglichen (Görke & Stülke, 2008). Hierzu wird die Expression der Gene...

Einleitung 6 2.3.1 Die zentralen Komponenten der KKR: CcpA – HPr und Crh – Glukose-6-P und FBP Die Auflösung der Kristallstrukturen der Komplexe CcpA-HPrSer46P- cre (Schumacher et al. , 2004) und CcpA-CrhSer46P- cre (Schumacher et al. , 2006) ermöglichten Einblicke in den Aufbau und die Funktionalit...

Einleitung 7 lokalisiert sind oder diesen überlappen (z.B. amyE (Kim et al. , 2005)). Die stromabwärts gelegenen cre - Sequenzen können sich im 5‘-untranslatierten Bereich (z.B. xynP (Galinier et al. , 1999), hut cre 2 (Wray et al. , 1994)) oder im Strukturgen (z.B. xylA (Jacob et al. , 1991)) befin...

Einleitung 9 2.3.4 CcpA-vermittelte Repression am Beispiel von xynP und xylA Die Verwertung der sekundären Kohlenstoffquelle Xylan bzw. Xylose wird durch die Genprodukte der Operons xynPB sowie xylAB vermittelt (Abb. 2.4). Die Repression von xynP (kodiert für Xylosidtransporter) und xylA (kodiert fü...

Einleitung 10 Abb. 2.4 : Verwertung von Xylan in B. subtilis (nach Singh et al. , 2008). Xylan wird durch extrazelluläre Xylanasen in Xylanoligosaccharide abgebaut und über den Xylosidtransporter XynP in die Zelle aufgenommen. Die β-Xylosidase XynB zerlegt diese Oligosaccharide in Xylose, welches mi...

Einleitung 16 2.6 Zielsetzung der Arbeit Die KKR in B. subtilis ist qualitativ bereits gut erforscht. Bisherige Studien untersuchten die Kinetik der Protein-Komponenten der CcpA-abhängigen Regulation. Die Reaktion der Zelle auf das An- bzw. Abschalten der Regulation, die Rate der Transkriptbildung, ...

Material und Methoden 17 3 Material und Methoden 3.1 Materialien 3.1.1 Chemikalien Tab. 3.1 : Chemikalien Chemikalie Bezugsquelle Adenosintriphosphat (ATP) Roche, Penzberg, Deutschland Agar Merck, Darmstadt, Deutschland Agarose PeqLab, Erlangen, Deutschland Ammoniumchlorid Merck, Darmstadt, Deutschl...

Material und Methoden 26 3.4 Oligonukleotide Die Oligonukleotide, die in dieser Arbeit verwendet wurden (Tab. 3.7), wurden von MWG Biotech AG (Ebersberg) bezogen. Tab. 3.7 : Verwendete Oligonukleotide. Die Schnittstellen sind einfach unterstrichen und der T7-Promotor doppelt unterstrichen gekennzeic...

Material und Methoden 31 Spurensalze, 100 x (S)* 60 mg/l Na 2 MoO 4 *2H 2 O 43 mg/l CuCl 2 *2H 2 O 60 mg/l CoCl 2 *6H 2 O 100 mg/l MnCl 2 *4H 2 O 170 mg/l ZnCl 2 Die Spurensalz-Lösung wurde bei Raumtemperatur im Dunkeln gelagert. FeCl 3 -Lösung, 50 mM mit 100 mM Zitronensäure (S)* 13,5 g/l FeCl 3 *6...

Material und Methoden 32 3.6 Puffer und Lösungen Alle in dieser Arbeit verwendeten Puffer und Lösungen wurden, soweit nicht anders vermerkt, mit deionisiertem Wasser angesetzt und gegebenenfalls für 20 min bei 121°C autoklaviert (A) bzw. mittels Sterilfilter (Porengröße 0,2 µm) sterilisiert (S). 3.6...

Material und Methoden 36 3.7.5 Anlegen von Bacillus -Dauerkulturen Für die Erstellung einer Dauerkultur wurden 4 ml LB-Medium mit entsprechender Antibiotikazugabe in einem Reagenzglas mit einer Einzelkolonie beimpft und über Nacht bei 37°C auf dem Schüttler inkubiert. Am Folgetag wurde die Zellsuspe...

Material und Methoden 37 3.7.6.2 Lebendtiterbestimmung Für jede Probe erfolgte die Bestimmung des Lebendtiters, indem zwei aufeinander folgende Verdünnungsstufen je nach erwarteter Zellzahl gewählt und jeweils im Doppelansatz quantifiziert wurden. Dazu wurden mit M9 SysMO Verdünnungen von 1:50.000 b...

Material und Methoden 42 Unter Verwendung von Gleichung (3.3) wurde die Transkriptmenge je KbE ermittelt: N(100ng): Anzahl Transkripte in 100 ng Gesamt-RNA; V(RNA): Gesamtvolumen des RNA-Eluats der Präparation; c(RNA): Gesamt-RNA- Konzentration; V(Probe): Kulturvolumen entsprechend 5 OD 600 -Äquival...

Material und Methoden 43 3.7.11 RNA-Hybridisierung (Dot Blot) Die Analyse der Genexpression auf mRNA-Level erfolgte durch quantitative RNA-Hybridisierungsexperimente. Nachfolgend wird die Herstellung des in vitro -Transkripts als Basis für die Standardkurve sowie der hochspezifischen RNA-Sonden erlä...

Material und Methoden 44 Natriumacetat zugefügt. Anschließend erfolgte die Fällung der RNA durch Zugabe von 1,5 ml eines eiskalten 1:1 Ethanol-Aceton-Gemischs und Inkubation für 1 h bei -20°C. Danach wurde die RNA durch 30-minütiges Zentrifugieren pelletiert und das Pellet zweimal mit 70 % (v/v) Eth...

Material und Methoden 45 3.7.11.3 Durchführung des Dot Blots Für die Analyse der Genexpression mittels RNA-Hybridisierungs- experimenten wurde jede Probe auf eine Konzentration von 3 µg Gesamt- RNA pro 100 µl Blottingwasser eingestellt. Die positiv geladene Nylonmembran wurde in 10 x SSC äquilibrier...

Material und Methoden 46 Blockierlösung, 1 x 1 Teil 10 x Blockierlösung 9 Teile 1 x Maleinsäurepuffer Aliquots à 10 ml wurden bei -20°C gelagert. Waschpuffer I 2 x SSC 0,1 % (w/v) SDS Waschpuffer II 0,2 x SSC 0,1 % (w/v) SDS Detektionspuffer (A) 0,1 M Tris-Base 0,1 M NaCl Der Puffer wurde mit 1 M Na...

Ergebnisse 49 4 Ergebnisse 4.1 Optimierung des Minimalmediums M9 Das Durchführen von Analysen in unabhängigen Laboren und anschließendes Zusammenführen der gewonnenen Daten zur Erstellung eines dynamischen Computermodells erforderte eine SOP-basierte Arbeitsweise, um gleichbleibende und damit vergle...

Ergebnisse 50 0,01 0,1 1 10 0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 OD 600 t [min] Abb. 4.1: Wuchskurve von B. subtilis 168 in M9 SysMO ohne ( ▲ ) und mit (  ) Zugabe von 100 µM Natriumcitrat. Durch Zugabe von Natriumcitrat verdoppelt sich die Wuchs-rate auf 0,648 h -1 . 4.2 Optimierung der Vorkultur ...

Ergebnisse 51 Abb. 4.2: Wuchsverhalten von B. subtilis 168 in Abhängigkeit der optischen Dichte der Vorkultur. Wenn die Vorkultur zum Zeitpunkt der Inokulation der Hauptkultur eine optische Dichte von über 0,6 aufwies (A), verlangsamte sich die Wuchsrate der Hauptkultur. Hatten die Zellen der Vorkul...

Ergebnisse 52 Abb. 4.3: Wuchsverhalten von B. subtilis 168 (WT,  ) und B. subtilis WH1117 ( xylR :: erm , ▲ ). Die Insertion der Erythromycinresistenzkassette beeinflusste die Wuchsrate von B. subtilis nicht. B. subtilis WH1117 erfüllte damit die Kriterien der SOP bezüglich der Wuchsrate und konnte...

Ergebnisse 55 Tab. 4.1: Gesamtmenge RNA aus 5 OD-Äquivalenten B. subtilis in Abhängigkeit der Elutionsmethodik bei der Präparation der Gesamt-RNA Nach Hersteller- angaben (50 µl) Doppeleluat (4x 30 µl) Einzeleluat (10x 30 µl) Exponentielle Phase 17,7 µg 30,49 µg 26,74 µg Transitionspunkt 10,36 µg 20...

Ergebnisse 59 4.4.4 Klonierung der Plasmide pWH2348 ( xynP ) und pWH2349 ( xylA ) Die Quantifizierung absoluter mRNA-Mengen in einer RT-qPCR-Reaktion basierte auf dem Mitführen einer Verdünnungsreihe des entsprechenden Standardplasmids mit bekannten Konzentrationen. Die daraus erstellte Standardkurv...

Ergebnisse 61 4.4.6 Etablierung der externen Standardkurve der RT-qPCR für xynP Die Validierung der externen Standardkurve für die Quantifizierung der xynP - mRNA auf der Basis von pWH2348 erfolgte analog zur Durchführung für xylA (siehe Punkt 4.4.5). Die so erstellte Standardkurve erreichte eine PC...

Ergebnisse 63 4.5 Konstruktion von B. subtilis WH1117 und B. subtilis WH1118 Der Einfluss der CcpA-vermittelten Regulation in B. subtilis auf die Expression von xylA und xynP wurde ohne Einfluss des Repressors XylR untersucht. Hierfür wurden die ∆xylR -Stämme WH1117 und WH1118 konstruiert. Dazu wurd...

Ergebnisse 68 4.7 β-Galaktosidase-Aktivitätsmessungen von xylA und xynP 4.7.1 β-Galaktosidase-Aktivität von xylA::lacZ Um die Expression einer xylA::lacZ -Fusion in einem B. subtilis -Stamm mit einer in dieser Studie erstellten xylR -Deletion zu vergleichen, wurde mittels Transformation mit pWH484 e...

Ergebnisse 71 4.8 RNA-Hybridisierung zur Detektion des xynP -Transkripts Die Validierung der absoluten Quantifizierung der Transkriptkonzentrationen mittels RT-qPCR erfolgte zusätzlich zu β-Galaktosidase-Aktivitätsmessungen über eine Analyse per RNA-Hybridisierung. Die Auflösung und die Sensitivität...

Ergebnisse 72 Abb. 4.13: Schematische Darstellung der Konstruktion genspezifischer RNA- Sonden. Mittels der Oligonukleotide der qPCR wurde das hochspezifische PCR-Produkt der real-time PCR, ergänzt um den T7- Promotor am 3‘-Ende, amplifiziert und anschließend per in vitro -Transkription in RNA umges...

Ergebnisse 73 Überquantifizierung der mRNA führen würde. Daher wurden die nachfolgenden RNA-Hybridisierungen ausschließlich qualitativ analysiert. Abb. 4.14: Vergleich der Signalintensität gleicher Kopienzahlen des in vitro - Transkripts von xynP im Abstand von 6 Tagen. Bei beiden eingerahmten Punkt...

Ergebnisse 74 Abb. 4.15: Dot Blot für die Detektion von xynP in Abhängigkeit des Zellwachstums. Die Werte über bzw. unter den Punkten entsprechen den Zeitangaben der Probennahme in min, bezogen auf den Übergang zur Stationärphase (t=0). Die Signalstärke der Proben ab 2 h nach diesem Übergang war deu...

Ergebnisse 75 Abb. 4.16: Bestimmung der Halbwertszeit der xylA -mRNA in B. subtilis WH1117 (A) und der xynP -mRNA in WH1118 (B). Die quantifizierten Transkriptmengen wurden gegen die Zeit nach Zugabe von Rifampicin aufgetragen. Aus dem exponentiellen Abfall der Kurve wurde die Halbwertszeit der mRNA...

Ergebnisse 77 4.11 Abhängigkeit der alsS -Expression in B. subtilis von der Kohlenstoffquelle 4.11.1 Konstruktion von B. subtilis WH1078, WH1079 und WH1126 Für die Analyse der Kohlenstoffkatabolitenregulation von alsS in Abhängigkeit der Kohlenstoffquelle wurde in verschiedene KKR-defiziente Stämme ...

Diskussion 81 5 Diskussion 5.1 Etablierung der absoluten Quantifizierung intrazellulärer Transkriptmengen in B. subtilis Die Reaktion der bakteriellen Zelle auf Umwelteinflüsse wie Hungerstress, Salzstress oder Sporulation spiegelt sich in der Änderung des Expressionsmusters bestimmter Gene wider. D...

Diskussion 85 (Singh et al. , 2008) (Abb. 4.12). Die Expression von xynP wird in einem xylR - Deletionsstamm durch CcpA allein stärker reprimiert als xylA (Abb. 4.9, 4.11). Dies zeigen auch quantitative Interaktionsstudien, bei der der CcpA- HPrSer46P-Komplex im Vergleich zur xylA-cre eine etwa 14-f...

Diskussion 87 5.4 Regulation der alsS -Expression in KKR- defizienten B. subtilis -Stämmen Die alsS -Expression wird indirekt positiv von CcpA beeinflusst, da stromaufwärts des Promotors des alsSD -Operons keine cre -Sequenz liegt, ccpA -Deletionsmutanten jedoch keine Aktivierung der Transkription z...

Abkürzungsverzeichnis 110 7 Abkürzungsverzeichnis % (v/v) Volumenprozent % (w/v) Massenprozent A XXX Absorption von bei einer Wellenlänge von xxx nm Abb. Abbildung Amp Ampicillin ATP Adenosintriphosphat BCAA verzweigtkettige Aminosäuren bla Resistenz-vermittelndes Gen gegen Ampicillin ( β-Lactamase)...

Versicherung an Eides statt Versicherung an Eides statt Hiermit erkläre ich an Eides statt, dass ich diese Arbeit selbstständig verfasst und keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe. Erlangen, den 21.12.2011 _____________________________

Erklärung über frühere Promotionsversuche Erklärung über frühere Promotionsversuche Hiermit erkläre ich, dass das vorliegende Schriftstück noch keiner anderen Prüfungsstelle vorgelegen hat und ich mich nicht in Erlangen oder anderswo ohne Erfolg einer Promotionsprüfung unterzogen oder zu promovieren...