AEG Micromat-Duo 30 TG- Anleitungen

1. Einleitung 1 1. Einleitung 1.1. Die Gattung Bartonella Die zu der Familie Bartonellacea gehörende Art Bartonella bacilliformis war bis Anfang 1990 die einzige bekannte Spezies der Gattung Bartonella. Lange Zeit waren nur drei Erkrankungen bekannt, die durch Bartonella spp. verursacht werden: Carr...

1. Einleitung 4 1.1.3. Bartonella bacilliformis B. bacilliformis kommt endemisch in den Anden vor und wird durch die Sandfliege Lutzomyia verrucarum übertragen (Amano et al. , 1997). Es handelt sich um den Erreger der biphasisch verlaufenden Carrion´schen Erkrankung. Die erste Phase (Oroya Fieber), ...

1. Einleitung 8 assoziiertes charakterisiertes Protein (Pap31) von B. henselae als ein Hämin-bindendes Protein identifiziert (Zimmermann et al. , 2003). Allerdings ist die Rolle von Fur und Pap31 in der B. henselae- Pathogenität bisher noch nicht untersucht worden. Als weiterer vermuteter Pathogenit...

1. Einleitung 9 OMPs 23-92 kDa äußere Membranproteine NF- κ B abhängige, pro- inflammatorische Wirtszellantwort (Fuhrmann et al. , 2001) OMP43 43 kDa äußeres Membranprotein Adhärenz an Endothelzellen (Burgess and Anderson, 1998) Fur eisenabhängiger Genregulator unbekannt, Einfluss auf transkriptione...

1. Einleitung 11 Auf der anderen Seite hätte die Stimulation der Angiogenese eine hohe therapeutische Potenz, wie z.B. in ischämischen Erkrankungen. Durch Stimulierung der Angiogenese könnte hierbei die Durchblutung des betroffen Gewebes (z. B. ischämische Herzerkrankungen) und damit dessen Nährstof...

1. Einleitung 12 Tab. 3: Angiogenetisch wirksame Wachstumsfaktoren. Gen Funktion Quelle Adrenomedullin Rolle in Tumorangiogenese, Gefäßentwicklung, Angiogenese der weiblichen Fortpflanzungsorgane, antiapoptotische Eigenschaften auf vaskuläre Endothelzellen, antiproliferative Eigenschaften auf glatte...

1. Einleitung 14 1.6. Regulation von HIF-1 Die α - und β -Untereinheiten des Transkriptionsfaktors HIF-1 werden konstitutiv exprimiert. Während ARNT jedoch unter Normoxie in konstanter Konzentration in der Zelle vorliegt, wird die HIF-1 α -Untereinheit unter Normoxie mit einer Halbwertszeit von weni...

1. Einleitung 16 ERK1/ERK2; Richard et al. , 1999; Conrad et al. , 1999; Berra et al. , 2000), sowie der Phosphatidylinositol 3'-kinase - phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10 - protein kinase B -Signalkaskaden (PI3-kinase/PTEN/Akt; Chen et al. , 2001; Jiang et al. , 2000; Zhong et...

1. Einleitung 17 wie z.B. durch Zytokine (TNF, IL-1), bakterielle Lipopolysaccharide, ultraviolette Strahlung und Wasserstoffperoxid (Li and Verma, 2002) und wird durch eine signalinduzierte proteolytische Degradierung von I κ B im Zytoplasma gesteuert. I κ B wird an zwei Serinresten der I κ B α -Un...

2. Material und Methoden 26 Anti-VEGF R&D Systems, Wiesbaden Sekundär-Antikörper Anti-Biotin, HRP-gekoppelt Cell Signaling, Frankfurt am Main Anti-Maus, HRP-gekoppelt Dako, Hamburg Anti-Hase, HRP-gekoppelt Cell Signaling, Frankfurt am Main Anti-Ziege, HRP-gekoppelt R&D Systems, Wiesbaden 2.1...

2. Material und Methoden 28 PHD2 (f) PHD2 (r) GCA CGA CAC CGG GAA GTT CCA GCT TCC CGT TAC AGT 176 (Metzen et al. , 2003) PHD3 (f) PHD3 (r) GGC CAT CAG CTT CCT CCT G GGT GAT GCA GCG ACC ATC A 175 (Metzen et al. , 2003) STC 2 (f) CAA CTC TTG TGA GAT TCG GG 520 diese Arbeit STC 2 (r) GAG GTG ATG TCC TG...

2. Material und Methoden 30 2.1.14. Bakterienstämme Bakterienstamm Beschreibung Quelle Bartonella henselae Marseille Wildtyp (Drancourt et al. , 1996) Bartonella henselae Houston I ATCC 49882 (Regnery et al. , 1992) Bartonella henselae Pil - häufig passagierter Marseille- Stamm, keine „Pilus“- Expre...

2. Material und Methoden 31 2.1.16. Zellkulturmedien Die Medien für die Zellkultur wurden steril angesetzt und bei 4°C gelagert. Das FCS wurde vor der Benutzung 30 min bei 60°C im Wasserbad inaktiviert. Für Infektionsexperimente wurden Medien ohne FCS und ohne Antibiotika verwendet. Zell-Linie Kulti...

2. Material und Methoden 41 im Heizblock inkubiert. Während der Inkubation wurde der RT-Mastermix (Tab. 4) auf Eis zusammenpipettiert, gevortext und kurz abzentrifugiert. Tab. 4: 1x Ansatz für den Mastermix der RT. Reagenzien Firma 1x Ansatz 5x First-Stand-Buffer Invitrogen 4,0 µl RNase-Out Invitrog...

2. Material und Methoden 42 Tab. 5: Pipettierschema für den Mastermix einer PCR. 1x Ansatz für PCR-Mastermix (Endvolumen: 50 µl) Firma 1x Ansatz H 2 0 bidest. 25,1 µl 10x PCR-Puffer (+ 15 mM MgCl 2 ) Roche 5,0 µl Nukleotide (je 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Roth 1,0 µl Primer (je 2 µM) Metabion 12,5...

2. Material und Methoden 43 2.2.10. Gelelektrophorese Nach der Inkubation wurden die PCR-Produkte entweder vorerst bei -20°C aufbewahrt oder gleich mit OrangeG Ladepuffer in einem Verhältnis 1:10 versetzt und mittels Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Die PCR-Produkte wurden durch Färbung mit...

2. Material und Methoden 44 Als Standard wurden kommerzielle Standards (Roche) eingesetzt. Die Kopienzahl der kommerziell erhältlichen Standards variieren von Charge zu Charge und wurden in 10er- Verdünnungen für die PCR eingesetzt. Als Reaktionsbedingung wurde für die IL-8- sowie für G-6-PDH-Real-T...

2. Material und Methoden 49 Standardgerade, ermittelt (Wellmann et al. , 2001). Der gesamte Ansatz wurde in den Glaskapillaren zentrifugiert und nach folgender Reaktionsbedingung amplifiziert (Tab. 12) : Tab. 12: Reaktionsbedingungen für VEGF- und KIAA0742-Real-Time-PCR. Danach wurde die Anzahl der ...

2. Material und Methoden 51 Versuchsansatz wurden nicht-infizierte bzw. infizierte Zellen mit Actinomycin D (Act D, Endkonz.: 5 µg/ml) behandelt, welches die weitere mRNA-Neusynthese inhibiert. Parallel dazu wurde in einem weiteren Versuchsansatz die mRNA-Neusynthese, sowie die aktivierte p38 MAPK d...

2. Material und Methoden 53 Abb. 9: Gen-Silencing vermittelt durch si RNA ( si RNA Technology and Applications, www.biomol.de; small interfering RNAs ( si RNA) A revolution in functional genomics, www.invivogen.com). Für si RNA-Experimente wurden HeLa-Zellen im 24 Well- (1 x 10 4 , 500 µl, VEGF-ELIS...

2. Material und Methoden 55 Lösung bei 595 nm im ELISA-Reader bestimmt. Mit bekannten Mengen an BSA (20; 2; 0,2 mg/ml) wurde eine Eichgerade erstellt und so die Proteinmenge der Extrakte bestimmt. 2.2.16. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Bei diesem Verfahren werden Proteine unter denaturierenden ...

2. Material und Methoden 56 Tab. 14: Pipettierschema für ein 3 %iges SDS-Sammelgel. 3 %iges Sammelgel ml H 2 O 2,1 30% Acrylamid Mix 0,5 1,5 M Tris (pH 8,8) 0,38 10 % SDS 0,03 10 % Ammoniumpersulfat (APS) 0,03 TEMED 0,003 Nach halbstündiger Polymerisation des Sammelgels erfolgte der Probenauftrag. D...

Tab. 15: Induzierte Gene in Epithelzellen (HeLa) 6h nach B. henselae Infektion. Nr. Gen Abkürzung Induktion Induktion Transkriptions- Biologische Funktion Genbank Array a Light Cycler b faktor Zugangszahl U95A RT-PCR c vaskuläre Proliferation 1. Interleukin-8 IL-8 6.41 5.80 b NF- κ B angioproliferat...

3. Ergebnisse 62 3.2. Verifikation der Gentranskription B. henselae -infizierter HeLa-Zellen auf mRNA-Ebene Um die Induktion einiger Gene, die auf dem Gen-Chip induziert waren, auf mRNA-Ebene mittels RT-PCR und quantitativer (Real-Time-) PCR zu bestätigen, wurden HeLa-Zellen mit B. henselae infizier...

3. Ergebnisse 64 VEGF (pg/ml) 3.3. Analyse der Genexpression B. henselae- infizierter HeLa-Zellen auf Proteinebene Nachdem die Gen-Chip-Daten auf mRNA-Ebene bestätigt werden konnten, bestand die nächste Aufgabe darin, die Expression einiger auf dem Gen-Chip induzierter Gene mittels ELISA (VEGF, IL-8...

3. Ergebnisse 66 gezeigt werden, dass die NF- κ B-vermittelte Zytokininduktion von der HIF-1-vermittelten proangiogenetischen Antwort abzutrennen ist, da die Zugabe des NF- κ B-Inhibitors Parthenolid vor der Infektion zu einem starken Abfall der B. henselae -induzierten IL-8- Sekretion führt, die VE...

3. Ergebnisse 71 Abb. 16: Posttranskriptionelle Regulation der VEGF-Gentranskription in HeLa-Zellen nach B. henselae -Infektion. HeLa- Zellen wurden mit B. henselae (MOI 500) infiziert und für 6 h inkubiert. Nach der Inkubation wurden die nicht-infizierten bzw. infizierten Zellen zusätzlich mit Act....

3. Ergebnisse 73 bzw. zu einer 4,5-fachen IL-8-Geninduktion. Wurden die Zellen jedoch mit der BadA - - Mutante infiziert, war im Vergleich zu den nicht-infizierten Zellen keine Geninduktion zu erkennen. Vergleicht man weiterhin die mRNA-Level der nicht-infizierten Zellen mit B. henselae Wildtyp- ode...

3. Ergebnisse 75 Vergleich zu den Kontroll-Zellen keine Induktion des Transkriptionsfaktors zu erkennen. Somit kann anhand der Ergebnisse beider Versuche (Abb. 18, 19) die Schlussfolgerung gezogen werden, dass B. henselae BadA, nicht aber jedoch B. henselae LPS, für die HIF-1- Aktivierung entscheide...

3. Ergebnisse 79 3.10. Verifikation der Gentranskription B. henselae -infizierter Endothelzellen auf mRNA-Ebene Zunächst wurde die Induktion einiger der auf dem Gen-Chip induzierten Gene verifiziert (VEGF, IL-8, ADM, MCP-1, GM-CSF). Anschließend wurde verglichen, ob einige in Epithelzellen (HeLa) du...

3. Ergebnisse 81 Wie der Vergleich von nicht-infizierten mit B. henselae -infizierten Zellen in Abb. 21 zeigt, sekretieren HUVEC im geringen Maße den vaskuloproliferativen Wachstumsfaktor VEGF (8 +/- 11,3 pg/ml) nach einer B. henselae -Infektion. Die IL-8- Sekretion in HUVEC zeigt nach einer B. hens...

3. Ergebnisse 82 Infektion von Endothelzellen, den angenommenen Zielzellen von B. henselae ebenfalls in einer Induktion eines angiogenetischen Genmusters resultiert (Seubert et al. , 2002; Dehio, 2001), wie in vitro im HeLa-Modell gezeigt werden konnte. Für eine HIF-2-Aktivierung nach einer B. hense...

3. Ergebnisse 84 den anderen Bakterien lässt darauf schließen, dass die VEGF-Sekretion kein generelles Phänomen ist und dass nur B. henselae in der Lage ist, die Sekretion beider angioproliferativ wirksamen Zytokine zu induzieren. Da von B. henselae außerdem bekannt ist, Apoptose in Wirtszellen zu i...

Tab. 17: Nukleotidsequenzen mit der Transposon-Insertionsstelle der Transposon-Mutanten mit erhöhter bzw. verminderter Fähigkeit zur Induktion der VEGF-Sekretion. Mutante Nukleotidsequenz 5’-3’ (Die Insertion des Transposons EZ::TN<KAN-2>Tnp ist durch <Tn> angegeben) Insertionsstelle 54 ...

4. Diskussion 90 4.1. Induktion einer proangiogenetischen Wirtszellantwort nach B. henselae -Infektion 4.1.1. Induktion einer proangiogenetischen Wirtszellantwort im HeLa-Zellkulturmodell Neben HHV-8, das die vaskuloproliferative Erkrankung „Kaposi Sarkom“ (KS) hervorruft (Chang et al. , 1994; Flore...

4. Diskussion 93 Außer diesen aus der Literatur bekannten Genen, wurde die Induktion zweier unbekannter Gene, die durch B. henselae induziert wurden (KIAA0742, FLJ22182fis), mittels RT-PCR verifiziert. Für das Gen KIAA0742, das ebenfalls mittels quantitativer PCR verifiziert werden konnte (Abb. 10) ...

4. Diskussion 95 4.2. Rolle der Transkriptionsfaktoren HIF-1 und NF- κ B in der Aktivierung der proangiogenetischen Wirtszellantwort nach B. henselae -Infektion 4.2.1. Aktivierung von HIF-1 nach einer B. henselae -Infektion Da Hypoxie der physiologische Hauptstimulus für die VEGF-Sekretion darstellt...

4. Diskussion 96 In HUVEC konnte außer der Aktivierung von HIF-1 noch die Aktivierung von HIF-2, eines aus der gleichen Familie stammenden Transkriptionsfaktors, anhand von Western Blots nachgewiesen werden (Abb. 22) . Die B. henselae -induzierte HIF-2-Aktivierung in Endothelzellen wird durch Veröff...

4. Diskussion 97 Somit konnte durch verschiedene Methoden auf molekularer Ebene in vitro und in vivo der Nachweis erbracht werden, dass der Transkriptionsfaktor HIF-1 der Schlüsseltranskriptionsfaktor in der B. henselae- induzierten Angiogenese zu sein scheint. Ein weiteres Argument das für HIF-1 al...

4. Diskussion 99 Das in HeLa- und HUVEC-Zellen durch B. henselae induzierte HIF-1-regulierte proangiogenetische Genmuster und die Induktion des NF- κ B-regulierten sowohl proinflammatorisch als auch angiogenetisch wirksamen Zytokins IL-8, führte zur Etablierung eines hypothetischen Modells einer B. ...

4. Diskussion 100 Die Hypothese, dass B. henselae in der Wirtszelle Sauerstoff und Energie verbraucht, konnte experimentell bestätigt werden (Abb. 35) . Der Vergleich von B. henselae- infizierten mit nicht-infizierten HeLa-Zellen zeigte eine Sauerstoffabnahme in B. henselae -infizierten Zellen. Anha...

4. Diskussion 102 PHDs und FIH-1 durch Gen-Silencing-Versuche mittels PHD- bzw. FIH- si RNA auf B. henselae -infizierte Hela-Zellen überprüft werden. 4.4. Posttranskriptionelle Regulierung der VEGF-Expression durch die p38 MAPK Durch die hier beschriebenen Gen-Chip-Experimente mit HeLa- und HUVEC-Ze...

4. Diskussion 106 4.6. Induktion einer angiogenetischen Wirtszellantwort nach B. henselae - Infektion: eine einzigartige Pathogenitätsstrategie? 4.6.1. Vergleich von HIF-1-Aktivierung, VEGF-, IL-8-Geninduktion und Proteinsekretion nach bakterieller Infektion Da B. henselae auf mRNA- sowie auf Protei...

5. Zusammenfassung 113 angezeigter Gene beobachtet, von denen HK2 bekanntermaßen eine Rolle in der Glykolyse spielt und KDR einen endothelzellspezifischen VEGF-Rezeptor darstellt. 5) Mittels Western Blots wurde die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren HIF-1 und HIF-2 in HUVECs nach einer B. hensel...

8. Anhang 154 Abb. 28: Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF- κ B nach B. henselae -Infektion von HeLa-Zellen. (a) Detektion der NF- κ B-Aktivität mittels EMSA. Die Kernextrakte wurden 2 h nach B. henselae -Infektion (MOI 500) hergestellt. Die Extrakte wurden mit einer radioaktiv-markierten Sonde...

8. Anhang 158 Abb. 33: Nachweis von HIF-1 α in HeLa-Zellen nach Infektion mit B. henselae, Y. enterocolitica, E. coli und L. pneumophila . HeLa-Zellen wurden mit B. henselae (MOI 250), Y. enterocolitica pYV + , Y. enterocolitica pYV - (MOI 20), E. coli HB 101, E. coli HB 101 inv + (MOI 100) und L. p...

8. Anhang 159 Abb. 34: Messung der Zellviabilität von HeLa-Zellen nach Infektion mit B. henselae, Y. enterocolitica, E. coli und L. pneumophila . (a) Darstellung der Zellviabilität mittels Giemsa-Färbung nach Infektion (12, 24, 48 h) von Hela Zellen mit B. henselae (MOI 250) , Y. enterocolitica pYV ...

9. Publikationen und Kongressbeiträge 161 9. Publikationen und Kongressbeiträge Publikationen Kempf, V.A.; Lebiedziejewski, M.; Alitalo, K.; Wälzlein, J.H.; Ehehalt, U.; Fiebig, J.; Schütt, B.; Sander, C.; Müller, S.; Grassl, G.; Brehm, B.; Autenrieth, I.B. (2005) Activation of Hypoxia-Inducible Fac...

9. Publikationen und Kongressbeiträge 162 Vorträge auf wissenschaftlichen Kongressen Thema: Activation of HIF-1 in bacillary angiomatosis: evidence for a role of HIF-1 in bacterial infections. Veranstaltungen: • Blaubeuren, 7./8.04.2002 Forschergruppentreffen der DFG (Antragnummer: FG 449), Bakterie...