AEG oko arctis 1153 GS- Anleitungen

Inhaltsverzeichnis 3.4 T EIL 4: S TRATEGIEN ZUR I NHIBIERUNG DER P R P S C -P ROPAGIERUNG 64 3.4.1 E PIGALLOCATECHIN -G ALLAT FÜHRT ZUR V ERMINDERUNG VON P R P C UND P R P S C 64 3.4.2 D IE A KTIVITÄT VON EGCG IST ABHÄNGIG VON DESSEN DREI H YDROXYL -G RUPPEN DER T RIHYDROXYPHENYL -S EITENKETTE 65 3....

Inhaltsverzeichnis 5.6 S ONSTIGE M ATERIALIEN 93 5.7 G ERÄTE 94 6 METHODEN 97 6.1 P OLYMERASE -K ETTENREAKTION (PCR) 97 6.1.1 S TANDARD -PCR 97 6.1.2 R EKOMBINANTE -PCR 97 6.1.3 PCR-B EDINGUNGEN 98 6.1.4 S EQUENZIERUNGEN 98 6.1.5 G ENERIERUNG DER P R P- UND B CL -2-K ONSTRUKTE 99 6.2 B AKTERIENKULTU...

Inhaltsverzeichnis 6.4.17 I N VITRO T RANSLATION 110 6.4.18 M ITOCHONDRIEN -I MPORT -A SSAY ( IN VITRO -I MPORT ) 110 6.4.19 C O -I MMUNPRÄZIPITATION 111 6.4.20 S UCROSE -G RADIENT 112 6.4.21 I SOLATION VON P ROTEINEN IN D ETERGENZ - RESISTENTEN -M EMBRANEN 112 6.5 I NDUKTION VON Z ELLSTRESS 113 6.6...

Zusammenfassung 1 1 Zusammenfassung Prion-Erkrankungen sind tödlich verlaufende neurodegenerative Krankheiten, die in vererbbarer, übertragbarer und sporadischer Form auftreten. Für Prion-Erkrankungen ist die sequentielle Umfaltung des zellulären Prion-Proteins (PrP C ) in eine abnormal gefaltete Fo...

Einleitung 2 2 Einleitung 2.1 Prion-Erkrankungen Prion-Erkrankungen sind eine Gruppe tödlich verlaufender, neurodegenerativer Krankheiten, die sowohl beim Menschen als auch beim Tier auftreten (Collinge, 2001; Prusiner, 1998). Aufgrund ihrer Übertragbarkeit (Transmissibilität) und Pathologie – einer...

Einleitung 6 Krankheit Jahr der Erstdokumentation und Ort des Auftretens Ursache sCJK 1920 Deutschland unbekannt fCJK 1924 Deutschland Keimbahn-Mutation im PrP-Gen GSS 1928 Österreich Keimbahn-Mutation im PrP-Gen Kuru 1957 Neu Guinea ritueller Kannibalismus iCJK 1974 USA Infektion durch ärztliche Be...

Einleitung 7 Abbildung 3: Schematische Darstellung des Prion-Protein. Pathogene Mutationen sind rot, polymorphe Varianten grün und blau eingefärbt dargestellt. Abbildung aus (Collinge, 2001). Die iatrogene Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (iCJK) wird durch medizinische „Unfälle“ auf den Menschen übertrag...

Einleitung 8 der Symptomatik, der Krankheitsdauer und den pathologischen Charakteristika. So bricht die sporadische Form der CJK bei Patienten im Alter zwischen 60 und 70 Jahren auf; die nvCJK dahingegen schon wesentlich früher, hier liegt das Durchschnittsalter bei 29 Jahren. Hereditäre Formen der ...

Einleitung 9 2.2 Das Prion-Konzept 2.2.1 Identifizierung des Prion-Proteins Die Infektiosität und Diversität der Prion-Erkrankungen stellen Forscher vor die Frage, wie diese Krankheit übertragen wird und wie sie zu den beobachteten Symptomen führt. Zunächst hielt man langsam wirkende Viren ( Slow Vi...

Einleitung 10 ihren biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften (Tabelle 3). Zelluläres PrP C ist im Gegensatz zur infektiösen PrP Sc -Form in nicht-ionischen Detergenzien löslich und sensitiv gegenüber Proteinase K (PK). Messungen des Circulardichroismus und Fourier-Transform- Infrarot-Spektr...

Einleitung 11 Die Konversion in ein unlösliches Prion-Protein konnte zwar erfolgreich in vitro induziert werden, es konnte jedoch lange Zeit in vitro keine Infektiosität generiert werden (Caughey et al., 1995). Dies führte zu der Annahme, dass noch ein zusätzlicher Faktor, genannt Protein X, oder an...

Einleitung 13 Abbildung 6: Biogenese des Prion-Proteins. (1) PrP wird an freien Ribosomen im Zytosol translatiert und co- translational in das raue Endoplasmatische Retikulum (ER) importiert. Während des Imports wir die ER-Signalsequenz abgespalten und Zuckerketten werden mit dem Protein verknüpft. ...

Einleitung 14 viele der krankheitsassoziierten Mutationen (Abb. 3). Im Gegensatz zu dem strukturierten C- Terminus ist die N-terminale Domäne (AS 23-120), zumindest unter den NMR Analyse- Bedingungen, unstrukturiert und extrem flexibel. Sie enthält fünf Oktarepeats (Wiederholungen der acht AS PQGGTW...

Einleitung 15 2.4 Die physiologische Funktion des Prion-Proteins 2.4.1 PrP C knock-out Mäuse Obwohl das Prion-Protein bereits vor 20 Jahren entdeckt wurde, ist noch immer unbekannt, welche physiologische Funktion es innehat. Die hohe Konservierung in Säugern, sowie die Existenz des Gens in Organisme...

Einleitung 16 2.4.2 PrP C – mögliche neuroprotektive Kapazität Weder konstitutive noch konditionale PrP knock-out Mäuse zeigen unter physiologischen Bedingungen einen signifikanten Phänotyp (siehe 1.4.1). In logischer Konsequenz stellt sich nun die Frage, wie sich das Fehlen des Prion-Proteins unter...

Einleitung 17 2.4.3 PrP C – mögliche Rolle in Signaltransduktionsprozessen Der Großteil von PrP C ist an der Zelloberfläche lokalisiert. Daher liegt die Vermutung nahe, dass das Prion-Protein eine Rolle in Signaltransduktionswegen spielen könnte. Wie viele andere GPI-verankerte Proteine auch, ist Pr...

Einleitung 18 Histidin-Resten an Position 96 und 111 in humanem PrP C identifiziert werden (Hornshaw et al., 1995; Jackson et al., 2001). Es wurde postuliert, dass Kupfer als ein Kofaktor für eine bisher unentdeckte enzymatische Aktivität von PrP dient. Umstritten ist eine Superoxid- Dismutase (SOD)...

Einleitung 19 Abbildung 9: Neurodegeneration und Infektiosität sind voneinander trennbare Prozesse. Die Konversion von PrP C zu PrP Sc führt zur Neurodegeneration und vermittelt Infektiosität. Verschiedene PrP-Mutanten sind ebenfalls in der Lage Neurodegeneration zu vermitteln, ohne dabei infektiöse...

Einleitung 21 2.6 Neurodegeneration und Apoptose Differenzierte Neuronen gehören zu den langlebigsten Zellen des Körpers. Dennoch stirbt während der Entwicklung des neuronalen Netzwerks eine große Zahl der Neuronen ab. Doch nicht nur während der Entwicklung sondern auch in akuten und chronischen Pha...

Einleitung 22 Hierbei wird das BH3- only Protein BID durch die aktive Caspase-8 zu tBID geschnitten. Diese Form von BID ist in der Lage den intrinsischen Apoptoseweg zu induzieren. Der intrinsische Weg wird hauptsächlich über zytosolische Proteine der Bcl-2-Familie reguliert (siehe 1.6.2). Letztlich...

Einleitung 24 only Proteinen und BAX oder BAK keine direkten Interaktionen nachgewiesen wurden, können BH3-only Mitglieder wie BAK die Todeskompetenz von BAX/BAK über Interaktionen mit dem anti-apoptotischen Protein Bcl-2 erhöhen (Cheng et al., 2001; Letai et al., 2002; Zong et al., 2001). Die Aktiv...

Einleitung 25 2.7 Therapeutische Ansätze für Prion-Erkrankungen Prion-Erkrankungen sind durch lange Inkubationszeiten und einen extrem progressiven Krankheitsverlauf gekennzeichnet. Obwohl die Krankheit bereits im letzten Jahrhundert diagnostiziert wurde, existiert noch immer keine Therapiemöglichke...

Ergebnisse 27 3 Ergebnisse 3.1 Teil 1: Neurotoxische Mechanismen bei Prion-Erkrankungen: Aggregation von missgefaltetem PrP in verschiedenen Zellkompartimenten Die Missfaltung und Fehllokalisation von PrP scheint bei der Pathogenese von Prion- Erkrankungen eine zentrale Rolle zu spielen. Eine Studie...

Ergebnisse 30 kompetenten Mitochondrien (-valinomycin), sowie der Protektion vor Proteinase K-Verdau (- valinomycin, +PK) deutlich feststellen lässt (Abb. 14B). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich alle Lokalisationsmutanten in den jeweils erwarteten Kompartimenten befinden. Abbildung 14: MtP...

Ergebnisse 31 Sekretion des Proteins zu analysieren. Hierfür wurde das Medium einer TCA-Fällung unterzogen. PrP wurde mittels Western Blot unter Verwendung des monoklonalen Anti-PrP Antikörpers 3F4 detektiert. WtPrP war in Triton-DOC löslich und daher nahezu ausschließlich in der löslichen (S) Frakt...

Ergebnisse 32 Abbildung 16: Die missgefalteten PrP-Mutanten sind PK insensitiv . SH-SY5Y Zellen wurden mit wtPrP und den Lokalisationsmutanten transient transfiziert. Die Gesamtzelllysate wurden mit ansteigenden Konzentrationen an Proteinase K (PK) bei 4°C für 30 Minuten inkubiert. Unverdautes PrP w...

Ergebnisse 33 Die biochemische Charakterisierung weist darauf hin, dass alle Lokalisationsmutanten in vergleichbarem Maße als Detergenz-unlösliche Protein-Aggregate vorliegen. 3.1.3 Zytosolisches PrP wird proteasomal degradiert In den vorangegangenen Analysen konnte festgestellt werden, dass zytoPrP...

Ergebnisse 34 3.1.4 Aggregation von PrP im Zytosol ist toxisch Nachdem festgestellt werden konnte, dass die biochemischen Eigenschaften der PrP- Mutanten im Nukleus, Zytosol, Mitochondrien und ER vergleichbar sind, sollte nun das toxische Potential der einzelnen Mutanten untersucht werden. Da zytoso...

Ergebnisse 35 Abbildung 19: Missfaltung von PrP im Zytosol führt zur Induktion von Apoptose. SH-SY5Y Zellen wurden mit EYFP und wtPrP bzw. den Lokalisationsmutanten transient co-transfiziert. 20 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen in An- oder Abwesenheit des proteasomalen Inhibitors MG132 (3...

Ergebnisse 36 3.1.5 Zytosolische Formen pathogener Deletionsmutanten induzieren Apoptose Die oben aufgeführten Experimente demonstrieren, dass die zytosolische Lokalisation von PrP Apoptose induzieren kann. Es stellt sich die Frage, ob eine solche Fehllokalisation von pathophysiologischer Bedeutung ...

Ergebnisse 37 Abbildung 20: Pathogene Mutanten verbleiben partiell im Zytosol. ( A ) schematische Darstellung der pathogenen Mutanten. Es wurden je 2 Versionen jeder Mutante hergestellt, eine mit authentischer ER-Signalsequenz (ER-SS) und eine mit deletierter ER-SS (zyto). ( B-C ) SH-SY5Y Zellen wur...

Ergebnisse 38 Aktivität von den zytosolischen Formen ausgeht (Abb. 21). Ob die Fraktionen mit geschnittener Signalsequenz additiv zu dem toxischen Effekt beitragen kann anhand dieser Experimente nicht ausgeschlossen werden. Interessanterweise zeigt die Mutante Q160Stop bereits in Abwesenheit von MG1...

Ergebnisse 39 Serums 3B5 aus Zelllysaten unter leicht denaturierenden Bedingungen immunpräzipitiert. Das Immunpellet wurde durch Aufkochen in Puffer A (0,5 % Triton X-100, 0,5 % DOC in PBS) aufgelöst und FLAG-Bcl-2 in einer zweiten Immunpräzipitation durch den monoklonalen Antikörper Anti-FLAG M2 is...

Ergebnisse 40 mittels Western Blot detektiert. Beide PrP-Mutanten befinden sich in der untersten Fraktion des Gradienten (Abb. 23A, Mitte) während Bcl-2 in den obersten Fraktionen des Gradienten zu detektieren ist (Abb. 23A oben). Unter Co-Expression von zytoPrP kommt es zu einer Veränderung der Bcl...

Ergebnisse 41 ihrer aggregierten Konformation in der untersten Fraktion des Gradienten befindet (Henn et al., 2005), führt nicht zu einer Aggregation von Bcl-2 (Daten nicht gezeigt). 3.1.7 Kausaler Zusammenhang zwischen zytoPrP-Toxizität und Bindung an Bcl-2 Bcl-2 ist ein essentieller Bestandteil in...

Ergebnisse 42 3.1.7.2 Identifizierung der toxischen Domäne von PrP Um weitere Evidenzen für einen kausalen Zusammenhang zwischen zytoPrP-Toxizität und Bindung an Bcl-2 zu generieren, wurde die toxische Domäne von zytoPrP identifiziert. Hierfür wurden verschiedene Regionen deletiert und die generiert...

Ergebnisse 44 Abbildung 26: Toxizität von zytosolischen PrP ist mit der Interaktion mit und Aggregation von Bcl-2 gekoppelt. (A) SH-SY5Y Zellen wurden transient wie oben indiziert mit den jeweiligen Konstrukten co-transfiziert, in 0,1% Triton X-100 haltigem Puffer lysiert und mit dem Anti-FLAG M2 An...

Ergebnisse 45 Leervektor oder zytoPrP co-transfiziert und Bcl-2 unter Verwendung des Anti-FLAG Antikörpers gebunden (Abb. 29, WB anti-Bcl-2). Das gewonnene Immunpellet wurde mittels Western Blot auf die Co-Isolation von endogenem BAX untersucht (Abb. 29, WB: anti-BAX). In diesen Analysen zeigte sich...

Ergebnisse 47 Abbildung 27: Zytosolische Chaperone interagieren mit zytoPrP. (A) Für die Co- Immunpräzipitationsanalysen wurden SH-SY5Y Zellen mit zytoPrP und YFP-Hsp70 (Spur 4) oder nur mit zytoPrP (Spur 3) transfiziert. Die Zellen wurden metabolisch in Anwesenheit des proteasomalen Inhibitors MG13...

Ergebnisse 49 Abbildung 28: Zytosolische Chaperone interferieren mit der zytoPrP-induzierten Apoptose und dessen Co-Aggregation mit Bcl-2. (A) Die Überexpression von Hsp70/40 inhibiert die zytoPrP-induzierte Apoptose. SH- SY5Y Zellen wurden wie angegeben transfiziert und für 3 Stunden mit dem protea...

Ergebnisse 50 3.2 Teil 2: Die physiologische Funktion von PrP C Die physiologische Funktion von PrP C ist noch immer weitgehend ungeklärt. PrP knock-out Maus-Modelle zeigten keinen signifikanten Phänotyp. Erst Analysen in primären Neuronen- Zellkulturen deuteten darauf hin, dass PrP eine neuroprotek...

Ergebnisse 51 Diese Daten zeigen, dass unser Zellkulturmodell geeignet ist, eine Stress-protektive Aktivität von PrP zu analysieren. Das Modell stellt gleichzeitig die Grundlage für eine genauere mechanistische Analyse der protektiven Kapazität des Prion-Proteins, insbesondere für die Identifizierun...

Ergebnisse 54 3.2.4 Die hydrophobe Domäne vermittelt die Dimerisierung von PrP C Nachdem gezeigt werden konnte, dass die hydrophobe Domäne für das Stress-protektive Potential von PrP eine wichtige Rolle zu spielen scheint, sollte die Bedeutung dieser Domäne genauer analysiert werden. Da die Aktivier...

Ergebnisse 57 3.3 Teil 3: Die Funktion von PrP C für die toxische Aktivität von PrP Sc Transgene Mausmodelle zeigten, dass die Propagierung von PrP Sc nur dann zum neuronalen Zelltod führt, wenn GPI-verankertes PrP C auf Neuronen exprimiert wird. Im Folgenden sollte versucht werden, einen genaueren ...

Ergebnisse 58 Abbildung 35: Scrapie-propagierende N2a Zellen sind sensitiver gegenüber Stress. (A) ScN2a und N2a Zellen wurden in gleicher Dichte ausplattiert und für 5 Tage bis zur totalen Konfluenz wachsen gelassen. Die Zellen wurden in kalten Puffer A lysiert, zentrifugiert und PrP in der Deterge...

Ergebnisse 59 beobachten (Abb. 36A, S131C, ScN2a). Diese Experimente zeigen, dass eine Zunahme an PrP Sc /Prionen zu einer signifikanten Abnahme von PrP-Dimeren in ScN2a Zellen führt. Ob hierfür die Inhibition der Dimerisierung an sich, oder eine erhöhte Interaktionsaffinität der PrP Sc -Form mit Pr...

Ergebnisse 60 mittels Exosomen aktiv in das extrazelluläre Medium PrP-exprimierender Zellen freigesetzt wird (Alais et al., 2008; Fevrier et al., 2004; Vella et al., 2007). Für den Co-Kultivierungs-Assay wurden SH-SY5Y Zellen auf Deckgläschen ausplattiert und transient mit GFP-GPI (Kontrolle), wtPrP...

Ergebnisse 61 verankertem wtPrP in den co-kultivierten Zellen. Die Toxizität scheint zudem über Integration der N-terminalen und hydrophoben Domäne vermittelt zu werden. Abbildung 37: Scrapie-Prionen induzieren Apoptose in PrP C exprimierenden Zellen. (A) Schematische Darstellung des Co-Kultivierung...

Ergebnisse 62 3.3.4 PrP Sc induzierte Apoptose in PrP C exprimierenden Zellen ist mit der Aktivierung der Jun N-terminalen Kinase gekoppelt Die vorangegangenen Daten weisen auf einen apoptotischen Prozess hin, der durch PrP Sc , in wtPrP-exprimierenden SH-SY5Y Zellen induziert wird. Um einen genauer...

Ergebnisse 63 Zusammenfassend deuten diese Daten auf eine durch PrP Sc -vermittelte Modulation eines durch PrP C -regulierten Signaltransduktionsweg hin. Abbildung 38: Scrapie-Prionen induzieren unter Aktivierung des JNK Signalwegs Apoptose. (A) SH-SY5Y Zellen wurden mit EYFP und GFP-GPI oder wtPrP ...

Ergebnisse 64 3.4 Teil 4: Strategien zur Inhibierung der PrP Sc -Propagierung Wie bereits beschrieben handelt es sich bei Prion-Erkrankungen um Krankheiten, die unweigerlich zum Tode führen. Bisher existiert für diese Krankheit keine Behandlungsmöglichkeit. Einer der Vorteile im Bereich der Prion-Fo...

Ergebnisse 65 Abbildung 39: Die Bestandteile des grünen Tees Epigallocatechin-Gallat (EGCG) und Gallocatechin-Gallat (GCG) interferieren mit der Bildung von PrP Sc . N2a und ScN2a Zellen wurden für 3 Tage kultiviert. Die Zellen wurden für weitere 48 Stunden mit Gallocatechin-Gallat (GCG), Epigalloca...

Ergebnisse 66 Abbildung 40: EGCG und GCG zeigen unterschiedliche Aktivität. (A) Chemische Strukturen der getesteten grünen Tee-Extrakt-Substanzen. GCG: (-)-Gallocatechin-Gallat, EGCG: (-)-Epigallocatechin-Gallat und ECG: (-)- Epicatechin-Gallat. Die Hydroxylgruppen (fett) und die Gallat-Seitenketten...

Ergebnisse 68 Abbildung 41: Die Behandlung mit EGCG führt zur lysosomalen Degradierung von PrP C . (A, B) N2a Zellen wurden transient mit wtPrP transfiziert. (A) Die Zellen wurde mit ansteigenden Konzentrationen an EGCG und ECG inkubiert und PrP, in der Detergenz-löslichen (S) und –unlöslichen (P) F...

Diskussion 69 4 Diskussion Prion-Erkrankungen sind infektiöse, tödlich verlaufende, neurodegenerative Erkrankungen, die durch die Bildung von aberrant gefaltetem Prion-Protein (PrP) und einer äußerst progressiven Degeneration von Nervenzellen gekennzeichnet sind. Ein Großteil der Forschungsarbeiten ...

Diskussion 70 4.2 Zytosolisches PrP Ein möglicher Kandidat für das neurotoxische Agens bei Prion-Erkrankungen stellt zytosolisches PrP (zytoPrP) dar. Untersuchungen mit transgenen zytoPrP-exprimierenden Mäusen ergaben, dass bereits geringe Mengen an zytosolischem PrP zum neuronalen Zelltod führen ka...

Diskussion 71 Die Tatsache, dass zytosolisches PrP ein deutlich höheres toxisches Potential besitzt als PrP-Aggregate in anderen Zellkompartimenten, macht es zu einem potenten Kandidaten für das toxische Agens bei Prion-Erkrankungen. Allerdings hat PrP als GPI-verankertes Zelloberflächenprotein norm...

Diskussion 73 Bcl-2 liegt an Membranen verschiedener Organellen, wie dem ER, den Mitochondrien und dem Nukleus vor. Daher stellt sich die Frage, ob zytosolisches PrP preferentiell an eine der Bcl-2-Subpopulation bindet und so zu einer Organell-spezifischen Apoptoseinduktion führt. Diese Vermutung wi...

Diskussion 74 4.2.3 Modulation der zytoPrP-Toxizität – Implikationen für Prion-Erkrankungen Die zytoPrP-vermittelte Toxizität kann von verschiedenen Faktoren moduliert werden: der proteasomalen Aktivität, dem Chaperon-System sowie der Menge an Bcl-2. Das Proteasom- System ist in Zellen für den Abbau...

Diskussion 75 Autophagie (Hoyer-Hansen et al., 2007). Eine Dysregulation dieses Prozesses könnte durch die Interaktion zwischen Bcl-2 und zytoPrP zur Neurotoxizität beitragen. In diesem Zusammenhang erwähnenswert ist die Tatsache, dass bei Prion-Erkrankungen mehrfach eine Akkumulation von autophagis...

Diskussion 76 4.3.1.1 PrP C zeigt eine protektive Aktivität Grundsätzlich ist über den Mechanismus der Signaltransduktion GPI-verankerter Proteine wenig bekannt. Untersuchungen des GFR-alpha Proteins weisen darauf hin, dass GPI- verankerte Proteine über die Bindung von transmembranständigen Proteine...

Diskussion 77 Membrandomänen sind Plattformen für die Aktivierung von Signaltransduktionswegen und Proteine, die diese Prozesse vermitteln, liegen bevorzugt in diesen Bereichen vor. Die fehlende Assoziation von PrPCD4 mit diesen Mikrodomänen könnte eine Interaktion zwischen PrP und seinem Rezeptor v...

Diskussion 79 4.3.2 Funktionell aktives PrP C ist für die PrP Sc /Prionen-vermittelte Toxizität notwendig Verschiedene Analysen in Mäusen deuten darauf hin, dass PrP Sc nur dann toxisch ist, wenn GPI-verankertes PrP in Neuronen exprimiert wird (Brandner et al., 1996; Büeler et al., 1994; Chesebro et...

Diskussion 80 zeichnen sich durch hohe Mengen von PrP Sc aber ausbleibenden oder extrem schwachen klinischen Symptome aus (Chiesa and Harris, 2001). Wahrscheinlicher ist daher, dass bei der Interaktion zwischen PrP C und PrP Sc eine toxische PrP-Form entsteht (Abb. 44). Diese könnte entweder ein Zwi...

Diskussion 81 guten Blut-Hirnschranken-Gängigkeit als Anti-Prion-Mittel eingesetzt werden kann. Diesbezügliche Analysen in Mäusen werden momentan durchgeführt. Die Deletion der Vorläufer-Form von PrP Sc , PrP C , scheint bisher der einzig erfolgreiche Ansatz zu sein, Prion-Erkrankungen im Mausmodell...

Material 86 Shrimp-Alkaline-Phosphatase Roche Diagnostics, Mannheim T4-DNA-Ligase New England Biolabs, Schwalbach Trypsin Gibco BRL LifeTechnologies, Karlsruhe 5.1.6 Standard-Größenmarker für Proteine und Nukleinsäuren See Blue Plus2 Invitrogen, Karlsruhe Pre-Stained Protein Standard 1 kb DNA-Leiter...

Material 93 Minimal Essential Medium (MEM) Invitrogen, Karlsruhe Minimal Essential Medium Invitrogen, Karlsruhe ohne L-Methionin OPTIMEM 1 Invitrogen, Karlsruhe LB-Medium 1% NaCl 1% Bacto Trypton 0,5% Hefeextrakt Ampicillin wird nach dem Autoklavieren (20 min 120 °C) in einer Endkonzentration von 10...

Methoden 97 6 Methoden 6.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction ) (Saiki et al., 1988) dient der selektiven in vitro Amplifikation von DNA-Fragmenten mittels thermostabiler DNA- Polymerase und spezifischer Oligonukleotide ( Primer ). Zur Gener...

Methoden 99 6.1.5 Generierung der PrP- und Bcl-2-Konstrukte Alle PrP-Mutanten wurden in den Vektor pcDNA3.1/Zeo(+), der unter der Kontrolle des CMV (Cytomegalovirus)-Promotors steht, ligiert, um eine Expression in den verschiedenen Zelllinien zu ermöglichen. Als Matrize diente das Plasmid pcDNA-wtPr...

Methoden 100 Konstrukt Primerpaare Mutation Q160Stop HindIII-forw Q160Stop-rev C-terminale Stopmutation W145Stop HindIII-forw W145Stop-rev C-terminale Stopmutation zytoQ160Stop zytoPrP-forw Q160Stop-rev C-terminale Stopmutation Deletion der ER-SS zytoW145Stop zytoPrP-forw W145Stop-rev C-terminale St...

Methoden 102 Für die Mutante CD4 wurde die GPI-Signalsequenz von PrP (Aminosäure 231 bis einschließlich 255) durch die Transmembrandomäne von CD4, einem Co-Rezeptor des T- Zell-Rezeptors ausgetauscht (Winklhofer et al., 2003). Konstrukt Primerpaar Mutation Δ HD-S131C HindIII-forw / Δ HD-S131C-rev Δ ...

Methoden 103 Stunden lang bis zu einem OD590-Wert zwischen 0,4 und 0,6 kultiviert. Die Kultur wurde 5 Minuten bei 4°C und 3.750 rpm zentrifugiert. Das Bakterienpellet wurde in 100 ml eiskalten TFB1-Puffer resuspendiert, die Suspension 5 Minuten lang auf Eis inkubiert und anschließend 5 Minuten lang ...

Methoden 104 Penicillin G, 10 µ g/ml Streptomycin) und 2 mM Glutamin in Zellkulturschalen bzw. –flaschen bei 37 °C und 5% CO 2 kultiviert. Die Kulturen wurden alle fünf Tage passagiert, wobei die Zellen 1:8 und 1:16 gesplittet wurden. ScN2a-Zellen wurden im gleichen Rhythmus im Verhältnis 1:10 und 1...

Methoden 106 bei 4°C in Vivaspinröhrchen (Ausschlussgröße 30.000 MW) aufkonzentriert. Das Konzentrat wir für 10 Minuten mit Coomassie-Lösung inkubiert und anschließend auf Native Gele geladen (siehe 6.4.9). 6.4.7 Nachweis der Sekretion von Proteinen Um zu untersuchen, ob eine Sekretion der überexpri...

Methoden 110 Protein-Antikörper-Komplex wurde durch Inkubation bei 100°C in 0,5% Triton-DOC, 0,9% SDS Puffer aufgelöst und anschließend mit dem Co-IP-Antikörper für 16 Stunden bei 4°C inkubiert. Der zweite Protein-Antikörper-Komplex wird durch Zugabe von Trisacryl-Protein A oder G (abhängig vom Co-I...

Methoden 113 6.5 Induktion von Zellstress Zur Funktionsanalyse verschiedener PrP-Mutanten und von PrP C wurde deren Wirkung auf SH-SY5Y unter verschiedenen Zellstressbedingungen untersucht. Die transfizierten Zellen wurden für 3 Stunden mit unterschiedlichen Stress-Induktoren bei 37°C inkubiert und ...

Lebenslauf 126 9 Lebenslauf Name: Angelika Rambold Adresse: Auenstrasse 33 80469 München Tel.: 089/72656869 Geburtsdatum: 7. Februar 1978 Geburtsort: München Familienstand: ledig Doktorarbeit: seit April 2004 in der Gruppe von Prof. Dr. Jörg Tatzelt Thema: Funktionelle Charakterisierung des Prion-Pr...