AEG Arctis 1310 i- Anleitungen

1 Einleitung 9 aus der Membran herauslöst und somit der ASA zugänglich macht (Kolter & Sandhoff, 2005; Eckhardt, 2008). GalCer wird mit Hilfe des Enzyms Galaktocerebrosid ß-Galaktosidase in die Bestandteile Ceramid und Galaktose zerlegt (Abb. 1.6) Abb. 1.6: Abbau von Sulfatid. Der Abbau erfolgt ...

1 Einleitung 11 Interessanterweise zeigten Myelin- und Lymphozyten Protein (MAL)-defiziente-Mäuse ähnliche Veränderungen der Nerven (Schaeren-Wiemers et al., 2004). MAL ist ein tetraspan Lipid-Raft Protein, das eine Rolle bei der Bildung von Membran-Microdomänen im Myelin spielt (Erne et al., 2002)....

1 Einleitung 12 Tabelle 1 . Verschiedene Glykosphingolipid-Speicherkrankheiten . Dargestellt sind die jeweilige Speicherkrankheit mit dem entsprechenden Enzym-Defekt und die daraus resultierende Speichersubstanz. Lysosomale Krankheit Defektes Enzym Speichersubstanz(en) Betroffene Organe Farbersche K...

1 Einleitung 14 1.6 Metachromatische Leukodystrophie (MLD) Die Leukodystrophien sind genetisch bedingte progressive Krankheiten, die das Gehirn, das Rückenmark und umliegende Nerven betreffen. Der Terminus "Leukodystrophie" leitet sich von "leuko" [griechisch] = weiß und "dystrop...

1 Einleitung 17 1.7 Mausmodelle der metachromatischen Leukodystrophie Metachromatische Leukodystrophie ist eine genetische Erkrankung und wurde nur für den Menschen beschrieben. Daher gibt es in der Natur kein geeignetes Tiermodell (Gieselmann, 1998; 2003). Zur Klärung der Funktion von Genen und der...

2 Material und Methoden 20 2 Material und Methoden 2.1 Materialien und Chemikalien Alle verwendeten Chemikalien, Enzyme und Kulturmedien wurden von den Firmen Applied Biosystems, Biorad, Gibco, Merck, MoBiTec, Molecular Probes, Amersham Pharmacia Biotech, Qiagen, Fermentas, Roth und Sigma bezogen. S...

2 Material und Methoden 21 2.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterial 2.1.1.1 Geräte Gerät Firma Agarosegelkammern mit Zubehör Eigenbau, Biorad Brutschränke Forma Scientific, Thermo Electron, Dreireich Digital-pH-Meter 646 Knick, Berlin Eismaschine Ziegra, Isernhagen, Deutschland Elektrophoresekammern für ...

2 Material und Methoden 23 2.1.1.2 Verbrauchsmaterialien Material Firma DC-Aluminiumfolien 20x20cm Kieselgel Merck, Darmstadt 60 F254 DC-Platten 20x20 cm Kieselgel 60, Merck, Darmstadt Gefrierröhrchen Cellstar Cryo, Greiner, Frickenhausen Küvetten Sarsted, Nümbrecht 6/24er-Loch Mikrotiter-Platten Sa...

2 Material und Methoden 26 Poly-L-Lysin Sigma-Aldrich, Steinheim Trypsin (Trypsin/EDTA Lösung 1x) Gibco / Invitrogen, Karlsruhe Trypan Blau Lösung Sigma-Aldrich, Steinheim 2.1.5.2 Zelllinien Die Tabelle gibt die Zelllinien an, die in dieser Arbeit verwendet wurden. Von allen Zellen wurde regelmäßig ...

2 Material und Methoden 28 Kanamycin: Stammlösung: 10 mg/ml in H 2 O Arbeitskonzentration: 20 µg/ml Lysostaphin Stammlösung: 2,5 mg/ml in H 2 O Arbeitskonzentration: 100 µg/ml Genatamicin Stammlösung: 50 mg/ml in H 2 O Arbeitskonzentration: 15 µg/ml G418 Stammlösung: 50 mg/ml in H 2 O Arbeitskonzent...

2 Material und Methoden 29 Permeabilisierungs-/Blockingpuffer 0,05% Tween 20, (für den Nachweis von Sulfatid in Gewebe) 1% BSA / PBS 2.1.7.4 Lösungen für molekularbiologische und biochemische Methoden Lösung Zusammensetzung TE-Puffer 10 mM Tris-HCl, pH 8 1 mM EDTA 50 x TAE-Puffer 40 mM Tris 20 mM Es...

2 Material und Methoden 34 psB4.7-39CST* enthält die Cerebrosid-Sulfotransferase ohne Transmembran-Domäne und um 6 Basenpaare verkürzt (für stabile Zelllinie in CHO-K1 Zellen genutzt) pcDNA-AchE-Furin-CST* enthält die Cerebrosid-Sulfotransferase mit vorgeschalteter Acetylcholinesterase pcDNA-Seap-Fu...

2 Material und Methoden 37 2.1.12 Verzeichnis der Antikörper Zur Detektion von Proteinen im Western-Blot und in der Immunohistochemie wurden folgende Antikörper verwendet: Name Verdünnung Firma Antiserum ST2 1:500 (IF) Yaghootfam et al., 2007 Polyklonaler anti-MBP aus Kaninchen 1:5000 (WB) Chemicon ...

2 Material und Methoden 38 2.2 Versuchstiere 2.2.1 Wildtyp-Kontrolltiere Als Kontrollen wurden Tiere der Stämme C57BL/6, 129Ola und C57BL/6/129Ola verwendet. Die Tiere wurden sowohl von Charles River Deutschland (Kisslegg/Sulzfeld) bezogen, als auch aus eigener Zucht verwendet. 2.2.2 ASA-Knockout-Mä...

2 Material und Methoden 39 2.3 Anfertigung von Gewebeschnitten Um verschiedene Untersuchungen wie Anfärbungen von Proteinen und histologische Untersuchungen durchführen zu können, wurden von Mausgehirn-Gewebe mittels eines Mikrotoms wie auch eines Kryostaten Schnitte angefertigt. 2.3.1 Paraffinschni...

2 Material und Methoden 40 2.4 Mikrobiologische und Molekularbiologische Methoden 2.4.1 In vitro Transfektion von Zellen 2.4.1.1 Kultivierung von Zellen Sämtliche Arbeiten mit Säugerzellen fanden unter sterilen Bedingungen statt und es wurden ausschließlich sterile Einmalplastikmaterialien verwendet...

2 Material und Methoden 44 Herstellung des DNA- Liposomen-Komplexes : Zur Herstellung des DNA-Liposomen-Komplexes wurde folgender Ansatz pipettiert: DNA 5 µg Lipofectamin 2 µl DMEM (ohne FCS und Antibiotikum) 50 µl DMEM (ohne FCS und Antibiotikum) 50 µl Die DNA- und die Lipofectamin-Lösung wurden zu...

2 Material und Methoden 46 gewaschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Nach dem Waschen wurde der Sekundärantikörper ebenfalls für 60 Minuten im Dunkeln eingesetzt. Eine erneute Waschung mit PBS entfernte unspezifische Bindungen. Hiernach erfolgte eine Färbung des Zellkerns mit dem DNA-Farbst...

2 Material und Methoden 55 2.5.3.14 Herstellung von Adaptern Für die Erstellung von sehr kleinen DNA-Fragmenten, die mittels PCR-Amplifikation nicht möglich wären, wurden Oligonukleotid-Adapter erzeugt. Kurze Adapter können durch das Aneinanderlagern von Oligonukleotidstartermolekülen hergestellt we...

2 Material und Methoden 56 inkubiert. Im Anschluss erfolgte die Entfernung der DNA durch Zugabe von 2 μ l RNase- freier DNase I (10 U/ μ l) bei 37°C für 15 Minuten. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 μ l 200 mM EDTA gestoppt, und die synthetisierte RNA wurde erneut mit 0,1 Volumen 3 M Natriumacet...

2 Material und Methoden 57 anschließend für 8 Minuten in 0,2 M HCl und danach für 10 Minuten in 0,1 M TEA-Lösung inkubiert. In der Zwischenzeit wurden die Sonde in Hybridisierungspuffer mit 0,08 M DTT entsprechend ihrer Markierungssignalstärke verdünnt, für 5 Minuten bei 80°C inkubiert und bis zur V...

2 Material und Methoden 61 Blocklösung verdünnt und für 1.5h bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde die Membran 3 x für je 10 Minuten in TBS/Tween gewaschen und anschließend für 1 h mit dem in TBS/Tween verdünnten Sekundärantikörper inkubiert. Es folgte ein weiteres dreimaliges Waschen wie oben ...

2 Material und Methoden 64 ABC-Komplexes an den biotinylierten Sekundärantikörper war somit das Antigen mit einem großen Komplex „markiert“, was zu einer deutlichen Signalverstärkung bei der Visualisierung führte. Diese wurde mittels der Substrate 3,3´-Diaminobenzidin (DAB) oder Histogreen wie folgt...

2 Material und Methoden 65 Das Pellet wurde in 9 ml 30% Saccharose aufgenommen, in Ultrazentrifugenröhrchen überführt, vorsichtig mit 2-3 ml 10,5% Saccharose überschichtet und für 2 h bei 20000 rpm und 4°C in der Ultrazentrifuge im Ausschwingrotor zentrifugiert. Bei diesem Zentrifugation- Schritt sa...

2 Material und Methoden 66 2.6.5 Cerebrosid-Sulfotransferase-Assay Die transfizierten Zellen wurden in 20 mM Tris-HCl / 150 mM NaCl (pH 7,0) mit zugegebenen Protease Inhibitoren lysiert und der postnukleare Überstand auf eine Proteinkonzentration von 5-10 mg/ml eingestellt (s. 2.6.2.1). Für jede Pro...

2 Material und Methoden 70 2.6.7 ESI-MS (Elektrospray Ionisation-Massen Spektrometrie) von Lipiden Elektorspray-Ionisation-Massen-Spektrometrie wurde angewendet, um die quantitativen Unterschiede in den Lipiden verschiedener Genotypen, sowie die verschiedenen Fettsäuren- Kettenlängen von Sulfatid zu...

3 Ergebnisse 75 Abb. 3.1: Überlebenskurve der ASA/ApoE-Knockout-, ASA-Knockout- und Wildtyp-Mäuse (wt). Die ASA- und ASA/ApoE-Knockout-Tiere wiesen eine geringere maximale Lebensdauer auf als die Wildtyp Mäuse. Die mittlere Lebensdauer ist bei allen Tieren gleich. Es wurden beide Genera in die Kapla...

3 Ergebnisse 99 3.1.5 Zusammenfassung der Daten zu den biochemischen und immunhistochemischen Untersuchungen an MLD-Mausmodellen Anhand der Untersuchungen auf biochemischer und immunhistochemischer Ebene war festzustellen, dass die ASA/ApoE-Knockout-Mäuse eine verkürzte Lebensdauer im Vergleich zu d...

3 Ergebnisse 100 3.2 Transgene Thy-1-CGT-Mäuse: Analyse der letalen audiogenen Anfälle bei transgenen Mäusen, die einen erhöhten Sulfatid-Gehalt in Neuronen aufweisen Dieser Abschnitt beinhaltet die Analyse eines transgenen Mausmodells, den Thy1-CGT. Ein wichtiges Enzym des Sulfatid-Anabolismus ist ...

3 Ergebnisse 108 Abb. 3.22: In situ-Hybridisierung mit c-Fos-Immunhistochemie im Colliculus inferior. In A sind die Färbungen mit der CGT-RNA-Sonde und dem c-Fos-Antikörper (1:3000) zu sehen, jeweils von Thy-1-CGT- und Wildtyp-Mäusen. Der Maßstabbalken entspricht 50 µm (I-II), 20 µm (III-IV). In B i...

3 Ergebnisse 109 Abb. 3.23: Western-Blot und Lipid-Analyse des Gehirns von Thy-1-CGT-transgenen Mäusen. A: 50 µg Protein aus dem Homogenat (H) und der Plasmamembran (PM) Isolierung wurden aufgetragen und die Anreicherung der PM mit Na + /K + -ATPase-Antikörper (1:1000) und die Entfernung von Myelin ...

3 Ergebnisse 114 Diese Ergebnisse zeigen, dass der Anstieg an C18:0-GalCer und C18:0-Sulfatid der einzige signifikante Unterschied in der Lipidzusammensetzung in transgenen Neuronen ist. Das weist darauf hin, dass der erhöhte GalCer- und/oder Sulfatid-Gehalt in der neuronalen Plasmamembran der Grund...

3 Ergebnisse 117 3.2.7 Zusammenfassung der Ergebnisse der biochemischen und ESI-MS Untersuchungen an den transgenen Thy-1-CGT-Mäusen Die biochemischen Untersuchungen sowie die Analyse der Sulfatid-Spezies mittels ESI-MS zeigten, dass die transgenen Thy-1-CGT-Mäuse GalCer und Sulfatid in Neuronen syn...

3 Ergebnisse 121 keine wesentliche Verschiebung des Proteins in den Kulturüberstand stattgefunden und der Großteil der Proteine verblieb weiterhin in der Zelle. Abb. 3.30: Expressions-Nachweis der Fusionsproteine im Lysat von CHO-K1-Zellen. 72 h nach der Transfektion wurde Lysat aus den transient tr...

3 Ergebnisse 126 Abb. 3.34: Expressions-Nachweis der DPPIV(TM)-39CST-HA in CHO-K1 Zellen. 48 h nach der Transfektion wurden die transfizierten Zellen lysiert und je Spur 50 µg Protein aufgetragen. Der Nachweis der DPPIV(TM)-lCST-HA erfolgte zum einen mit dem 12CA5-AK (gegen die HA-Markierung; 1 µg) ...

4 Diskussion 134 4.1 Sulfatid-Akkumulation in Neuronen von ASA- und ASA/ApoE- defizienten Mäusen Zurzeit ist noch wenig bekannt, welchen Effekt eine erhöhte Sulfatid-Speicherung auf die verschiedenen Zell-Funktionen hat. Durch die Herstellung eines ASA-defizienten Mausmodells (Hess et al., 1996) wur...

4 Diskussion 135 Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Sulfatid-Akkumulation in den Neuronen von ASA- und ASA/ApoE-Knockout-Mäusen. Dabei sollte genau untersucht werden, ob eine ApoE- Defizienz einen Effekt auf die neuronale Sulfatid-Anreicherung hat. Die hierzu erzeugten Doppel-Knockout-Mäuse soll...

4 Diskussion 140 4.2 Analyse der Thy-1 CGT-Mäuse: C18-langkettiges Sulfatid löst letale audiogene Anfälle in transgenen Thy-1 CGT-Mäusen aus Sofern es das Muster der Lipidspeicherung betrifft, ähnelt das ASA-defiziente Maus-Model der humanen Metachromatischen Leukodystrophie (Wittke et al., 2004). A...

4 Diskussion 143 intensiven akustischen Reiz ausgelöst werden (Faingold et al., 1991a, b und 2000; Li et al., 1999; Zhang & Kelly, 2001). Wie kommt es nun zu den neuronalen Störungen, die sich evtl. auf die durch GABA bzw. Glutamat induzierte neuronale Hyperpolarisation bei den transgenen CGT-Ti...

4 Diskussion 147 4.3 Subzelluläre Lokalisations-Analyse der Cerebrosid-Sulfotransferase (CST): Retention der CST im Endoplasmatischen Retikulum In den vergangenen Jahren wurden verschiedene Ansätze untersucht, die eine Behandlung der lysosomalen Speicherkrankheit MLD ermöglichen. Mögliche Therapiefo...

5 Zusammenfassung 154 5 Zusammenfassung Metachromatische Leukodystrophie (MLD) ist eine genetisch bedingte Defizienz des lysosomalen Enzyms Arylsulfatase A und führt zur lysosomalen Akkumulation von Sulfatid sowie einer schwerwiegenden Demyelinisierung im zentralen Nervensystem des Menschen. Ein Tie...

8 Abbildungsverzeichnis 178 8 Abbildungsverzeichnis 1.1: Schematische Darstellung eines Neurons ………………………………… 3 1.2: Ceramidsynthese ……………………………………………..…………… 5 1.3: Sphingomyelin ……………………………………………………………. 6 1.4: CST katalysiert die Synthese von Sulfatid und SlacCer.………………….. 7 1.5: 3-O-Sulfogalaktosy...

8 Abbildungsverzeichnis 180 3.23: Western-Blot und Lipid-Analyse des Gehirns von Thy-1-CGT-transgenen Mäusen …………………………………………... 109 3.24: Quantitative Bestimmung der Sulfatid-Spezies in der Plasmamembran von Thy-1-CGT Mäusen ……………………………………………………….. 110 3.25: Analyse der Ganglioside von transgenen T...

11 Abkürzungsverzeichnis 185 11 Abkürzungsverzeichnis Anm Absorption bei einer Wellenlänge Abb. Abbildung AK Antikörper Amp Ampicillin APS Ammoniumpersulfat AS Aminosäure ASA Arylsulfatase A ATP Adenosin-5‘- Triphosphat Bp Basenpaar BSA Rinderserumalbumin cDNA komplementäre DNA CGT Ceramid-Galaktosy...

ii Eidesstattliche Erklärung Ich versichere, dass ich die von mir vorgelegte Dissertation selbständig angefertigt, die benutzten Quellen und Hilfsmittel vollständig angegeben und die Stellen der Arbeit – einschließlich Tabellen und Abbildungen -, die anderen Werken im Wortlaut oder dem Sinn nach ent...

iii Lebenslauf Curriculum Vitae Dipl. Biolog. Rebekka Maria van Zyl P E R S Ö N L I C H E D A T E N Name: Rebekka Maria van Zyl (geb. Berger) Adresse: Mühlenstr. 76, 50321 Brühl Telefon: 02232-90145 Familienstand : verheiratet Staatsangehörigkeit: deutsch A U S B I L D U N G 1989-1999 Gymnasium Erft...